免疫熒光的實驗主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片的處理以及細胞的活力，有人根據成功經驗總結出許多有益的細節或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。
免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，重要的區別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外，抗體濃度的選擇可能更加關鍵。后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。
由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個的免疫熒光實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優化外，還必須設立嚴謹的實驗對照。總之，免疫熒光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能終達到你的實驗目的。
抗原抗體反應，其具有高度的特異性。先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。
