免疫熒光（Immunofluorescence）通過特異性熒光抗體結合細胞內的生物靶標抗原，從而實現對靶標分子在細胞內的分布及定位分析。該方法可以對組織塊兒、培養細胞或單個細胞進行標記，用于分析蛋白、糖原、及生物/非生物小分子，與此同時，免疫熒光也可以DAPI、Hochest33342等其他非抗體熒光標記染料聯合使用。
　　
　　免疫熒光方法中的重要環節：
　　
　　1.冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
　　
　　2.組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。
　　
　　3.血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。
　　
　　4.一抗孵育條件：在免疫組化反應中重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。具體條件還要摸索。
　　
　　5.二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后去摸索一抗濃度和孵育時間。后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當的離心。
　　
　　6.復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。
　　
　　7.封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
　　
　　 8.切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min×3次，而一抗孵育后的清洗均為5次×5min。