流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法
PI 染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。
3、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定過夜。
4、離心，棄上清液。
5、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，離心。
7、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室溫避光孵育30min。
9、混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中， 4℃冰箱保存，待測。
GFP PI染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。
3、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃固定30min。 以下步驟同PI 染色操作步驟的（4-9）
細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、以冷PBA 1ml，離心洗滌，棄上清液。
3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、離心棄上清液。
5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
6、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測。
細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟
1-2、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
3、 用PBA稀釋的*抗體200ul，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心，棄上清。
4、 PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
5、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。
6、 PBS 1ml離心洗滌2次。
7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測。
胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500 rpm , 5 min，棄上清液。
2、用1×PBS 1 ml洗滌1次，離心。
3、4% PFA 1ml，4 ℃固定30min。
4、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
5、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min。
6、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
7、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30 min-1h。
8、離心棄上清液。
9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
10、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測。
胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟
1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
7、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動物IgG，輕輕吹打混勻，4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h。離心，棄上清。
8、冷PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200 ul。吹打混勻，4 ℃或置冰上孵育30 min，避光。
10、冷PBA 1ml離心洗滌2次。
11、將細(xì)胞重新懸浮于500 ul PBS中，混勻，置流式管中，避光，4 ℃冰箱保存，待測。
備注：
1、 RNase A： 貯液濃度：1mg/ml ；
工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 20ug/ml。
2、PI： 貯液濃度：2.5mg/ml；
工作液配制： 加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 50ug/ml。
3、PBA ： 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0.1%疊氮鈉。
4、檢測樣品細(xì)胞濃度1x10 /ml。
